strange laboratory of 레드라쿤

1.Subject

β-galactosidase의 활성.

2.Object

이온교환 크로마토그래피를 통해 β-galactosidase를 분리하고 protein의 활성을 측정한다.

3.Principle

◆ 이온교환 크로마토그래피

Ion-exchange chromatography를 통해 β-galactosidase를 분리를 한다. 일반적으로 사용되는 이온교환 수지의 충진제로는 SP Sephadex C-50를 이용하는데 이것은 강한 cation 교환제로 작용한다. 일반적으로 단백질은 구성 아미노산 중에 산성, 염기성 아미노산을 함유하므로 적당한 pH 조건하에서는 양(+)또는 음 (-)의 전하를 가지고 있기 때문에 관에 전해질의 고분자 물질인 SP Sephadex C-50를 충진제로 넣고 각종 단백질의 전하량과 충진제의 이온 상호작용의 차이에 따라 단백질을 분획하였다. Chromatography resin인 세파덱스(Sephadex)에 Sulfopropyl 기를 가지며 구조는 다음과 같다.

세파덱스는 단백질 분리에 자주 사용되는 겔로 다당류이고 큰 고분자 사슬에 있는 수산기 때문에, 매우 극성이며 많은 물을 흡수한다. 겔은 그들이 물을 재흡수하여 팽윤하는 능력에 따라서 특성을 나타낸다. 세파덱스 유형의 번호는 물의 재흡수 값에 관계된 것이다. 일반적으로 Sephadex겔은 물에 녹지 않으며 약한 산화제, 환원제, 약한 염기에 대해서 안정한 특징을 가진다.

◆ 세파덱스 수지(resin)

유기물질의 작은 무정형(비결정성) 입자이다. 복잡한 유기산 및 그 유도체로 이루어진 고체 또는 반고체이다. (위의 그림과 같은 구조로 존재)

Sulfopropyl는 음전하를 가져 양이온을 흡착하는 고분자 담체가 cation exchanger, 양이온을 가져 음이온을 흡착하는 고분자 담체가 anion exchanger로 작용하며 이온교환체를 column을 채우면 서로 반대하전을 가지는 단백질로 이동이 정지되어 결합한다. 단백질의 기질간의 화합정도는 pH와 관을 흐르는 용액의 이온의 강도에 의해 좌우되며, 효과적인 분리를 위하여 이런 조건을 다양하게 조절 한다.

◆ 양이온 교환기

모체 합성수지(세파덱스)에 R기로 Sulfopropyl 기가 결합되어 있는 고분자 산의 형태이다. 이때 산성기는 물 속에서 이온화하여 옥소늄 이온(HO)를 생성한다.

RAH + HO ⇄ RA + HO

옥소늄 이온이 물 속에 염기 및 중성염의 성분인 양이온과 교환한다.

◆ β-galactosidase

β-galactosidase는 유제품에 함유되어 있는 젖당을 가수분해하여 포도당과 갈락토오스를 생산하는 효소이다. 이 효소는 젖당의 소화, 흡수가 어려운 사람에게 적합한 유제품을 제공하며 부가적으로 젖당 함유제품의 감미도와 용해성을 증대시켜주는 특징이 있다. 그러나 β-갈락토오스해리효소의 가수분해 반응은 조건에 따라 매우 다르며, 특히 가수분해 중에 갈락토오스를 전이하여 올리고갈락토오스류 혹은 갈락토오스다당(galatooligosccharide)을 생성하기도 한다.

① 효소반응

β-galactosidase에 의한 젖당의 가수분해 및 올리고갈락토오스 생산은 Wallenfels와Makhtra(1960)가 제안한 당전이 반응 메커니즘으로 설명 가능하다. 즉 효소가 갈락토오스를 전이하는 받게 분자가 물이면 가수분해이고 받게 분자가 젖당이면 올리고갈락토오스가 생산되는 반응이다. 이 이론에 따르면 젖당가수분해는 갈락토오스 전이반응의 특별한 경우라 보았다. 이러한 견해에서 본다면 β-galactosidase는 가수분해 효소가 아니라 전이효소로 분리될 수 있다.

② 효소의 특성

β-galactosidase의 생화학적 특성은 매우 상이하며 일부 특성은 효소출처에 따라 분류될 수 있다. 가장 큰 분자량을 가지는 것은 대장균에서 유래한 것으로 520,000에서 850,000 Da의 크기를 가진다. 최적 온도는 효소마다 매우 상이하며 최적 13°C에서 최고 60°C 이상까지 사용 가능하다. 많은 경우 온도안정성을 증대시키기 위하여 효소를 고정화하여 사용한다. 일반적으로 곰팡이와 박테리아 유래의 효소가 효모 유래의 것보다 온도 안정성이 우수하다. 생성물저해(product inhibition) 또한 효소출처에 영향을 받는 중요한 생화학적 특성이다. 일반적으로 젖당 가수분해 시에 생성되는 포도당과 갈락토오스는 효소의 활성을 감소시키는 저해제로 작용한다. 포도당은 비경쟁적 저해제로 작용하며 갈락토오스는 경쟁적 저해제로서 작용한다.

③ 효소의 화학합성

대부분의 β-galactosidase는 기질특이성이 크다. 따라서 반응기내에 젖당 이외에 다른 받게분자(acceptor molecule)를 넣어주게 되면 무작위적인 당 유도체가 형성된다.

◆ 단백질 활성검사

단백질 활성검사(enzyme assay)를 하면 단백질의 농도가 현저하게 떨어지기 때문에 단백질을 농축하는 과정이 필요하다.

① 유인법(Affinity adsorption)

묽어진 단백질 용액을 ion exchange column에 흘려주면 단백질이 ion exchange resin에 달라 붙는다. 이것을 소량의 high salt buffer로 용출 시키면 농축된 단백질을 얻을 수 있다. Ion exchange resin 대신 affinity chromatography resin을 사용하면 특정 단백질에 대해서는 효과가 대단히 좋을 수 있다.

② 여과법 (Ultrafiltration)

단백질은 물이나 buffer용 salt보다는 크기 때문에 적당한 크기의 filter를 사용하면 단백질만 남고 물과 buffer는 빠져가게 할 수 있다. 하지만 구멍이 작으면 일반적인 확산으로는 잘 빠져나가지 않는다. 그래서 압력이나 원심력을 이용하여 투석막을 통과하게 만드는 것이다. 이 원리의 실험 장치가 있는데 Ultrafiltration kit (혹은 Stirred cell)로 압력을 견딜 수 있는 조그만 (50, 100, 250 ml)원통형의 cell과 고압 질소를 연결할 수 있는 tube와 연결 joint, 압력을 빼낼 수 있는 stop cock, 그리고 filter를 놓을 수 있는 base등으로 구성되어있다. 4atm의 N2을 사용하는 이유는 강제로 밀어내기 위함이고 공기가 아닌 N2를 쓰는 것은 단백질의 산화를 막기 위해서이다.

또 다른 방법은 원심분리기의 원심력을 이용하는 것인데 이건 좀 소형, 소량의 시료를 빨리 처리할 때 좋다. Filter를 사이에 둔 2 개의 tube의 위쪽에 시료를 넣고 돌리면 원심력에 의해 모두 아랫쪽 tube로 빠져나가게 되는데 단백질은 분자량이 커서 filter에 걸리고 물만 빠집니다. 다 빠진뒤에 아랫 tube를 바꾸고 filter를 거꾸로 달고 다시 돌리면 filter에 걸려있던 단백질들이 새로운 아래 tube로 떨어져 나오게 된다.

③ 침전법 (Selective precipitation)

물에 녹아 있는 단백질만을 고체로 침전시키는 방법이다. 그 다음에 원심분리해서 분리하면 된다. 기본적인 원리는 salting out이라고 볼 수 있다.물에 단백질이 녹아 있다는 말은 단백질들이 물 분자와 물리적으로 결합해서 외견상 물과 구별할 수 없는 상태로 존재한다는 말이다. 그래서 사용하는 것이 물과 친화력이 강한 단백질 아닌 다른 물질들을 첨가해주는 겁니다. charge를 많이 가지고 있는 salt들이 적합한데 대표적으로 ammonium sulfate [(NH4)2SO4]이 있다. 이런 salt나 solvent가 물에 녹을 때 열이 발생하기 때문에 salt는 cold chamber에서 천천히 넣어주고 solvent는 미리 차갑게 식혀두었다가 사용해야한다.