1.Subject
Kjeldahl법을 통한 crude protein의 정량
2.Object
Kjeldahl법을 통하여 crude protein에 포함된 질소의 양을 통해 단백질의 양을 측정한다.
3.Principle
◆ 조단백질
단백질은 다른 성분과 달리 평균 16%의 질소를 함유하고 있는 것이 특징이다. 질소는 단백질에서 특유의 성분이지만, 질소를 함유하고 있다고 하여 반드시 단백질이라고는 할 수 없다. 식품 중에는 아미노산, purine 및 pyrimidine 염기의 유도체, amide 화합물, 핵산 화합물, 요소 등의 여러 가지 비단백태의 질소화합물이 함유되어 있으며, 이들은 종류에 따라서 그 조성이 다르다. 일반적으로 총 질소에 6.25를 곱한 것(질소계수 : 100 / 16 = 6.25)이 며 총 단백질 양을 나타내는 것은 아니다. 따라서 이것을 조단백질(crude protein)이라고 한다.
◆ Kjeldahl법
Kjeldahl법은 유기질소를 정량하는 가장 흔한 방법으로 중화적정을 이용한 정량법이며 주로단백질, 우유, 곡류, 및 밀가루에 존재하는 질소를 정량하는 방법이다. 이 과정은 직접적이며 특별한 장치가 필요 없고, 수많은 시료의 일상분석에 쉽게 적용된다.
이 방법의 원리는 Kjeldahl장치를 이용하여 조단백질의 총 질소 함량을 측정하여 질소의 %를 단백질로 전환하는 것으로서, 식품 내 모든 질소는 단백질로서 존재한다고 가정하고 식품 단백질 내 질소의 % 함량에 기초한 질소계수(F)를 사용한다.
Kjeldahl법은 분해, 증류, 중화, 적정의 네단계를 거친다.
1) 분해
시료에 진한 황산과 분해 촉진제를 가해 가열하면 식품성분의 분해가 시작되어 유기물의 탈수탄화와 산화환원반응이 일어나 시료 중의 질소는 암모니아로 되고 분해플라스크 중에 잔존하는 진한 황산과 다음과 같이 반응하여 황산암모늄의 형태로 분해액 중에 포집된다.
실험과정에서 첨가한 분해촉진제는 진한 황산과 다음과 같은 반응을 한다.
그러나 가열, 분해 중에는 제거되고, 본 반응은 반복되어 용액은 더욱 진하게 되며 유기물의 반응은 격렬하다.
◆ 질소-단백질 환산계수
조단백질은 일정한 비율로 질소를 함유하기 때문에 조단백질의 질소량을 정량하여 여기에 특정한 환산 계수를 곱하여 산출한다. 단백질이 함유하는 질소의 비율은 조단백질의 종류에 따라 다르므로 각각의 특정한 환산 계수가 정해져 있으나 개별 계수를 알 수 없는 조단백질은 모두 6.25의 계수를 쓴다.
4.Material
① 진한 H2SO4 : 시료분해용 (d: 1.83g/ml)
② 혼합촉매 : K2SO4 9g과 CUSO4 . 5H2O 1g 을 유발로 분쇄, 혼합하여 사용한다. 이때 K2SO4 는 황산에 용해하여 그의 비등점을 높여주고 분해를 촉진하는 역할을 한다.
③ 0.1N-H2SO4 용액
④ 0.1N-NAOH 용액
⑤ 중화용 NAOH용액 : 아질산을 함유하지 않은 NAOH 450g을 물 1L에 녹여 냉각 후 폴리에틸렌에 넣어 하룻밤 정도 정치시켜 탄산염을 침전시키고, 상층액만을 사용한다.
⑥ 혼합지시약 : 0.1% methyl red alcohol 용액과 0.1% methylene blue alcohol 용액의 등량 혼합용액으로 pH5에서 적자색, pH 4.5서 무색, pH 5.6에서 녹색을 띤다.
⑦ 비등석 : 경석을 직경 1~3mm 정도로 분쇄시켜 물로 씻고 500℃ 이상의 온도에서 가열하거나 외경 1~1.5MM경도의 유리관을 사용한다.
⑧ 분해장치 : 300~500ml 경질플라스크를 사용한다.
5.Method 1)시료준비 ● 시료 0.5g을 유산지에 정량하여 분해플라스크에 넣는다. ● 분해플라스크에 혼합촉매제를 넣는다. 2)분해 및 증류 ● 분해플라스크에 H2SO4 15ml을 넣고 kjeldahl장치에서 420℃에서 45분간 분해한다.
① 삼각플라스크(E)에 0.1N H2SO4 표준용액 20ml + 혼합지시약 4~5방울을 넣는다.
② 증류플라스크(C)에 희석 분해액 (10ml)를 깔대기(F)를 통해서 넣는다.
(증류수로 용기에 묻은 시료액을 씻어 넣음)
③ 수증기 발생플라스크(A)에 물(1/2)을 넣고 항온기로 가열한다.
④ 플라스크(A)에서 수증이가 밀려나오면 깔대기(F)를 통하여 중화용 NaOH용액을 적당량
가하여 증류플라스크(C)의 액이 알칼리가 되도록 한다.
⑤ 증류플라스크(C)에서 발생되는 암모니아는 플라스크(A)에서 나오는 수증기에 밀려서 냉
각관(D)를 통하여 삼각플라스크(E)로 들어가서 황산과 반응하여 (NH4)2SO4를 형성한다.
(약 30~40분간 증류)
⑥ 증류가 끝나면 삼각플라스크(E)를 들어내고 냉각관의 끝부분(G)을 증류수로 잘 씻어
삼각플라스크(E)안에 넣은 후 가열을 멈춘다.
⑦ 마지막으로 세척 과정에서는 삼각플라스크(E)를 들어내고 증류수를 넣은 용기를 놓고,
코크(c)를 열고, 코크(b)를 닫으면 감압에 의하여 용기의 물이 역류되어 증류플라스크(C)
가 세척되며 이때 역류병(B)에 모인 물은 코크(a)를 열어 제거한다.
● blank test 란 시료이외의 물질(시약, 황산, 증류수 등)에 질소가 존재할 수 있기 때문에
오차를 줄이기 위해서 실시하는 실험이다.
(Kjeldahl장치 사용 시 처음에는 blank test를(증류 플라스크에 물을 넣고 실험)을 한 후
두 번째 본 실험(증류 플라스크에 분해액을 넣음)을 하는 두 번의 조작을 거친다.)
3)중화
● 혼합지시약(Methyl Red+Bromocresol Green)과 4%H3BO3이 들어있는 붕산용액(붉은색)
을 20ml 삼각 플라스크에 측정하여 넣는다.
● 식힌 플라스크를 Hood에서 꺼낸 후 붕산용액을 kjeldahl증류 및 중화장치에 연결한다.
이때 kjeldahl 증류 및 중화장치의 한쪽에는 35%의 NaOH를 다른 한쪽에는 증류수를 장
치하여 증류 및 중화 과정을 통해 시료가 초록색으로 변하는 것을 확인한다.
4)적정
● 증류&중화과정이 끝난 삼각플라스크에 포집된 NH4H2BO3를 0.1N HCl를 이용하여 적정
하여 붉은색으로 변함 여부를 확인한다.(시료적정량)
● kjeldahl 증류&중화장치를 이용해 분해플라스크를 세척한다.
● 최종의 결과값을 계산 수식에 넣어 조단백질의 양을 구한다.
6. RESULT
ISP를 시료로 하여 시료의 채취량을 0.5g 으로 하고 혼합촉매 10g, 진한 H2SO4 20ml를 가하여 분해 한뒤 분해액을 200ml로 희석하여 20mL 채취한 뒤 증류과정을 시행하였다. 0.1N - H2SO4표준용액의 수기 채취량은 20ml이고 0.1N - NAOH 표준용액의 역가는 1.032 이였다. 여기서 0.1N - NAOH 용액의 적정소비량은 공시험때 18.9mL였고 본시험때 14ml였다. 그리고 콩단백의의 질소 - 단백질 환산 계수는 6.25이다. 이것으로 ISP의 조단백량을 계산하면 다음과 같다.
7. DISCUSSION & CONCLUSION
비공개 ^^
8.Reference
식품분석(이론과 실험), 신광출판사, 신효선, p.72 ~ 76
표준식품분석학, 지구문화사, 채수규 , p.242 ~ 255
최신분석화학, 자유아카데미, Daniel C. Harris (계산 수식 참고)
http://www.dslab.co.kr/src/main/indexpage.php(켈달장치의 구조 그림)
NK Chem 일반화학, megaMD, 남궁원, p.249
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