strange laboratory of 레드라쿤

1.Subject

β-galactosidase의 활성.

2.Object

이온교환 크로마토그래피를 통해 β-galactosidase를 분리하고 protein의 활성을 측정한다.

3.Principle

◆ 이온교환 크로마토그래피

Ion-exchange chromatography를 통해 β-galactosidase를 분리를 한다. 일반적으로 사용되는 이온교환 수지의 충진제로는 SP Sephadex C-50를 이용하는데 이것은 강한 cation 교환제로 작용한다. 일반적으로 단백질은 구성 아미노산 중에 산성, 염기성 아미노산을 함유하므로 적당한 pH 조건하에서는 양(+)또는 음 (-)의 전하를 가지고 있기 때문에 관에 전해질의 고분자 물질인 SP Sephadex C-50를 충진제로 넣고 각종 단백질의 전하량과 충진제의 이온 상호작용의 차이에 따라 단백질을 분획하였다. Chromatography resin인 세파덱스(Sephadex)에 Sulfopropyl 기를 가지며 구조는 다음과 같다.

세파덱스는 단백질 분리에 자주 사용되는 겔로 다당류이고 큰 고분자 사슬에 있는 수산기 때문에, 매우 극성이며 많은 물을 흡수한다. 겔은 그들이 물을 재흡수하여 팽윤하는 능력에 따라서 특성을 나타낸다. 세파덱스 유형의 번호는 물의 재흡수 값에 관계된 것이다. 일반적으로 Sephadex겔은 물에 녹지 않으며 약한 산화제, 환원제, 약한 염기에 대해서 안정한 특징을 가진다.

◆ 세파덱스 수지(resin)

유기물질의 작은 무정형(비결정성) 입자이다. 복잡한 유기산 및 그 유도체로 이루어진 고체 또는 반고체이다. (위의 그림과 같은 구조로 존재)

Sulfopropyl는 음전하를 가져 양이온을 흡착하는 고분자 담체가 cation exchanger, 양이온을 가져 음이온을 흡착하는 고분자 담체가 anion exchanger로 작용하며 이온교환체를 column을 채우면 서로 반대하전을 가지는 단백질로 이동이 정지되어 결합한다. 단백질의 기질간의 화합정도는 pH와 관을 흐르는 용액의 이온의 강도에 의해 좌우되며, 효과적인 분리를 위하여 이런 조건을 다양하게 조절 한다.

◆ 양이온 교환기

모체 합성수지(세파덱스)에 R기로 Sulfopropyl 기가 결합되어 있는 고분자 산의 형태이다. 이때 산성기는 물 속에서 이온화하여 옥소늄 이온(HO)를 생성한다.

RAH + HO ⇄ RA + HO

옥소늄 이온이 물 속에 염기 및 중성염의 성분인 양이온과 교환한다.

◆ β-galactosidase

β-galactosidase는 유제품에 함유되어 있는 젖당을 가수분해하여 포도당과 갈락토오스를 생산하는 효소이다. 이 효소는 젖당의 소화, 흡수가 어려운 사람에게 적합한 유제품을 제공하며 부가적으로 젖당 함유제품의 감미도와 용해성을 증대시켜주는 특징이 있다. 그러나 β-갈락토오스해리효소의 가수분해 반응은 조건에 따라 매우 다르며, 특히 가수분해 중에 갈락토오스를 전이하여 올리고갈락토오스류 혹은 갈락토오스다당(galatooligosccharide)을 생성하기도 한다.

① 효소반응

β-galactosidase에 의한 젖당의 가수분해 및 올리고갈락토오스 생산은 Wallenfels와Makhtra(1960)가 제안한 당전이 반응 메커니즘으로 설명 가능하다. 즉 효소가 갈락토오스를 전이하는 받게 분자가 물이면 가수분해이고 받게 분자가 젖당이면 올리고갈락토오스가 생산되는 반응이다. 이 이론에 따르면 젖당가수분해는 갈락토오스 전이반응의 특별한 경우라 보았다. 이러한 견해에서 본다면 β-galactosidase는 가수분해 효소가 아니라 전이효소로 분리될 수 있다.

② 효소의 특성

β-galactosidase의 생화학적 특성은 매우 상이하며 일부 특성은 효소출처에 따라 분류될 수 있다. 가장 큰 분자량을 가지는 것은 대장균에서 유래한 것으로 520,000에서 850,000 Da의 크기를 가진다. 최적 온도는 효소마다 매우 상이하며 최적 13°C에서 최고 60°C 이상까지 사용 가능하다. 많은 경우 온도안정성을 증대시키기 위하여 효소를 고정화하여 사용한다. 일반적으로 곰팡이와 박테리아 유래의 효소가 효모 유래의 것보다 온도 안정성이 우수하다. 생성물저해(product inhibition) 또한 효소출처에 영향을 받는 중요한 생화학적 특성이다. 일반적으로 젖당 가수분해 시에 생성되는 포도당과 갈락토오스는 효소의 활성을 감소시키는 저해제로 작용한다. 포도당은 비경쟁적 저해제로 작용하며 갈락토오스는 경쟁적 저해제로서 작용한다.

③ 효소의 화학합성

대부분의 β-galactosidase는 기질특이성이 크다. 따라서 반응기내에 젖당 이외에 다른 받게분자(acceptor molecule)를 넣어주게 되면 무작위적인 당 유도체가 형성된다.

◆ 단백질 활성검사

단백질 활성검사(enzyme assay)를 하면 단백질의 농도가 현저하게 떨어지기 때문에 단백질을 농축하는 과정이 필요하다.

① 유인법(Affinity adsorption)

묽어진 단백질 용액을 ion exchange column에 흘려주면 단백질이 ion exchange resin에 달라 붙는다. 이것을 소량의 high salt buffer로 용출 시키면 농축된 단백질을 얻을 수 있다. Ion exchange resin 대신 affinity chromatography resin을 사용하면 특정 단백질에 대해서는 효과가 대단히 좋을 수 있다.

② 여과법 (Ultrafiltration)

단백질은 물이나 buffer용 salt보다는 크기 때문에 적당한 크기의 filter를 사용하면 단백질만 남고 물과 buffer는 빠져가게 할 수 있다. 하지만 구멍이 작으면 일반적인 확산으로는 잘 빠져나가지 않는다. 그래서 압력이나 원심력을 이용하여 투석막을 통과하게 만드는 것이다. 이 원리의 실험 장치가 있는데 Ultrafiltration kit (혹은 Stirred cell)로 압력을 견딜 수 있는 조그만 (50, 100, 250 ml)원통형의 cell과 고압 질소를 연결할 수 있는 tube와 연결 joint, 압력을 빼낼 수 있는 stop cock, 그리고 filter를 놓을 수 있는 base등으로 구성되어있다. 4atm의 N2을 사용하는 이유는 강제로 밀어내기 위함이고 공기가 아닌 N2를 쓰는 것은 단백질의 산화를 막기 위해서이다.

또 다른 방법은 원심분리기의 원심력을 이용하는 것인데 이건 좀 소형, 소량의 시료를 빨리 처리할 때 좋다. Filter를 사이에 둔 2 개의 tube의 위쪽에 시료를 넣고 돌리면 원심력에 의해 모두 아랫쪽 tube로 빠져나가게 되는데 단백질은 분자량이 커서 filter에 걸리고 물만 빠집니다. 다 빠진뒤에 아랫 tube를 바꾸고 filter를 거꾸로 달고 다시 돌리면 filter에 걸려있던 단백질들이 새로운 아래 tube로 떨어져 나오게 된다.

③ 침전법 (Selective precipitation)

물에 녹아 있는 단백질만을 고체로 침전시키는 방법이다. 그 다음에 원심분리해서 분리하면 된다. 기본적인 원리는 salting out이라고 볼 수 있다.물에 단백질이 녹아 있다는 말은 단백질들이 물 분자와 물리적으로 결합해서 외견상 물과 구별할 수 없는 상태로 존재한다는 말이다. 그래서 사용하는 것이 물과 친화력이 강한 단백질 아닌 다른 물질들을 첨가해주는 겁니다. charge를 많이 가지고 있는 salt들이 적합한데 대표적으로 ammonium sulfate [(NH4)2SO4]이 있다. 이런 salt나 solvent가 물에 녹을 때 열이 발생하기 때문에 salt는 cold chamber에서 천천히 넣어주고 solvent는 미리 차갑게 식혀두었다가 사용해야한다.

1.Subject

탈지 대두분 제조 (Defatted soybean powder production)

2.Object

대두분에서 지방을 추출하여 단백질만 남긴 탈지 대두분을 만든다.

3.Principle

◆ 대두단백질

대두(콩)는 다른 식용작물 종자와 비교할 때 약 40%의 단백질을 함유하고 있다. 또한 유지함량이 높고 회분 함량이 높은 특징을 가지고 있다. 따라서 채유를 끝낸 탈지대두박을 물 또는 식염으로 추출하면 약 90%의 단백질을 얻을 수 있다.

대두단백질의 조성은 초원심분리법에 의한 침강계수(sedimentation constant)에서 2S, 7S, 11S, 15S의 4성분으로 구분되며, 추출단백질의 수용액을 pH 4.5~4.8의 산성으로 조절하면 단백질의 약 75%가 등전 침전되며 이것의 주성분은 글로불린이다. 항원․항체 반응에 따른 면역학적 분류에 의하면 글로불린(globulin)은 α-, β-, γ- globulin과 conglobulin의 4성분으로 나눌 수 있다. 산에 침전되지 않는 단백질은 훼이(whey) 단백질이라고 불리며, 2S와 7S 단백질의 주가 된다. 2S 단백질은 트립신 억제제(trypsin inhibitor)의 활성을 가지고 있다. 대두글로불린의 주성분은 glycinine(11S 성분)과 conglycinine(7S 성분)으로서 두 성분의 합은 대두글로불린의 약 70%이며, 두 성분의 비율은 품종에 따라 다소 차이가 존재한다.

◆ 대두단백질의 종류

대두단백질 제품은 보통 탈지대두 또는 탈지대두를 원료로 하여 가공한 제품을 말하며, 성분에 따라 다음과 같이 나누어 볼 수 있다.

►탈지콩가루(defatted soy flour)

►농축대두단백질(SPC, soy protein concentrate)

►분리대두단백질(SPI, soy protein isolate)

►섬유상대두단백질(fibrous soy protein)

1) 콩가루(soy flour)

콩가루는 탈지한 대두박이나 탈지하지 않은 대두를 미세하게 분쇄하여 분말화한 것으로서 일반적으로 입자의 크기가 100mesh 체를 통과한 것으로 규정하고 있다. 콩가루는 단백질이 많이 함유되어 있지만 글루텐이 함유되어 있지 않다는 점에서 밀가루와 구분되며, 섬유소가 함유되어 있다는 면에서는 탈지분유와 다르다. 콩가루는 전지콩가루, 탈지콩가루, 그리고 레시틴 또는 콩기름을 첨가한 콩가루로 나눌 수 있다.

콩가루의 제조과정 중에 열처리를 하는데, 이 이유는 대두의 비린 냄새를 제거하고, 효소를 불활성화 시키기 위해서이다. 그러므로 끓이거나 증기로 처리한 콩가루는 냄새가 크게 향상될 뿐만 아니라 트립신 저해제가 불활성화 되어 소화율이 향상된다. 그러나 가열처리에 따라 콩가루의 착색과 단백질 용해도가 감소되므로 가열방법과 가열온도, 가열시간은 적절히 조절되어야 한다.

2) 전지콩가루(whole soy flour)

전지콩가루는 대두를 6~8조각으로 분쇄한 다음, 분리한 표피를 제거한다. 표피를 제거한 자엽과 배아는 15분간 열처리한 후에 건조하여 미세한 가루로 만든 것을 말한다.

전지콩가루의 입자 크기는 97% 이상이 100mesh 체를 통과해야 하는데, 지방질이 많아 체의 사용이 어려우므로 일반적으로 송풍분리법(air classifier)으로 분리한다.

3) 탈지콩가루(defatted soy flour)

탈지대두분의 이용은 오래 전부터 많은 연구 및 사용되어졌는데, 대두단백질 제품을 식품에 이용하게 된 배경은 단백질 자원의 확보를 위한 노력과 더불어 각종 식품 가공제품의 증량제 또는 대체용으로 사용된다. 탈지콩가루는 조쇄하고 박피화된 대두에서 지방을 추출하고 남은 탈지대두박을 3단계에 거쳐 제조한 것이다.

►탈취→건조→마쇄

♳탈취과정 : 탈지대두박에 증기를 짧은 시간 통과시켜 불쾌한 냄새를 제거.

♴건조과정 : 단백질이 변성되지 않게 상온에서 건조.

♵마쇄과정 : Hammer mill로 분쇄하여 97% 이상이 100mesh 체를 통과.

위의 3단계 과정 후에 탈지콩가루에 지방 함량이 1% 이하이어야 하며 사용용도에 따라 성분을 첨가한다. (ex: 저지방 콩가루(low-fat soy flour)는 탈지콩가루에 지방을 첨가시켜 지방 함량이 4.5~9%가 되도록 조절)

탈지콩가루의 제조과정 중 단백질의 변성도에 따라 각각 고변성, 중변성, 저변성 콩가루로 구분하기도 하며 물성의 차이에 따라 이용 용도도 달라진다.

만약 단백질의 변성도가 높다라면 가용성 질소가 적어질 뿐만 아니라 유독물질의 불활성화, 영양가의 향상, 밀도의 증가, 조직의 경화와 투명성, 특유한 풍미가 있어서 사료용으로 이용된다. 중변성 탈지콩가루는 고변성 탈지콩가루에 비하여 착색이 덜 되지만 조직이 단단하여 간장이나 된장 제조를 위한 양조용으로 이용된다. 이에 비하여 저변성 탈지콩가루는 두부의 원료, 분리단백질의 제조원료 등 식품가공용으로 이용되고 있다.

산업적인 방법과는 달리 실험실에서는 전지콩가루(whole soy flour)의 지방성분을 유기용매로 제거 후 유기용매인 n-hexane 로 추출하여 탈지콩가루(defatted soy flour)를 만든다.

◆ n-hexane

헥세인(Hexane)은 알케인 탄화수소이다. 분자식은 CH3(CH2)4CH3로 표기된다. "hex" 라는 수식어는 탄소가 여섯 개임을 의미한다, "ane" 이라는 것은 각 탄소가 단일결합임을 뜻한다. 핵산 단일결합은 매우 안정적이다. 또한 극성을 띄지 않아서(무극성이어서) 유기용매로 널리 쓰이며 안정적이기 때문에 식품(콩, 옥수수등)으로부터 기름을 추출하기 위한 용매로 사용된다.

4.Material

전지대두분, 교반기, 마그네틱바, n-hexane, 비커, 호일, 필터페이퍼

5.Method

1) 전지대두분을 준비한 후 무게를 측정한다.

2) n-hexane을 측정한 전지대두분의 무게의 10배를 넣고 1시간정도 교반한다.

3) 교반이 완료되면 침전물이 쌓이고 위쪽 상층액(지질이 용해된 부분)을 버린다.

(침전물은 호일에 모아 건조하고 남아있는 상층액은 filtration 한다.)

4) 필터를 이용하여 상층액에 남아있는 침전물을 거른 후 사용했던 종이필터를 호일에

모아 따로 건조한다.

5) 건조가 완료되면 대두분에 남아있는 단백질의 %수율을 구한다.

6.Reference

Experimental Organic Chemistry (p.93~121)

식품분석(이론과 실험), 신광출판사, 신효선, p.72 ~ 76

표준식품분석학, 지구문화사 , 채수규 , p.242 ~ 255

http://www.soyworld.org/

http://fa.kfda.go.kr/common/vocabulary_view.jsp?currPage=1&SerialNo=1363

1.Subject

Kjeldahl법을 통한 crude protein의 정량

2.Object

Kjeldahl법을 통하여 crude protein에 포함된 질소의 양을 통해 단백질의 양을 측정한다.

3.Principle

◆ 조단백질

단백질은 다른 성분과 달리 평균 16%의 질소를 함유하고 있는 것이 특징이다. 질소는 단백질에서 특유의 성분이지만, 질소를 함유하고 있다고 하여 반드시 단백질이라고는 할 수 없다. 식품 중에는 아미노산, purine 및 pyrimidine 염기의 유도체, amide 화합물, 핵산 화합물, 요소 등의 여러 가지 비단백태의 질소화합물이 함유되어 있으며, 이들은 종류에 따라서 그 조성이 다르다. 일반적으로 총 질소에 6.25를 곱한 것(질소계수 : 100 / 16 = 6.25)이 며 총 단백질 양을 나타내는 것은 아니다. 따라서 이것을 조단백질(crude protein)이라고 한다.

◆ Kjeldahl법

Kjeldahl법은 유기질소를 정량하는 가장 흔한 방법으로 중화적정을 이용한 정량법이며 주로단백질, 우유, 곡류, 및 밀가루에 존재하는 질소를 정량하는 방법이다. 이 과정은 직접적이며 특별한 장치가 필요 없고, 수많은 시료의 일상분석에 쉽게 적용된다.

이 방법의 원리는 Kjeldahl장치를 이용하여 조단백질의 총 질소 함량을 측정하여 질소의 %를 단백질로 전환하는 것으로서, 식품 내 모든 질소는 단백질로서 존재한다고 가정하고 식품 단백질 내 질소의 % 함량에 기초한 질소계수(F)를 사용한다.

Kjeldahl법은 분해, 증류, 중화, 적정의 네단계를 거친다.

1) 분해

시료에 진한 황산과 분해 촉진제를 가해 가열하면 식품성분의 분해가 시작되어 유기물의 탈수탄화와 산화환원반응이 일어나 시료 중의 질소는 암모니아로 되고 분해플라스크 중에 잔존하는 진한 황산과 다음과 같이 반응하여 황산암모늄의 형태로 분해액 중에 포집된다.