1.Subject
DNS method에 의한 Reducing Sugar Determination
2.Object
환원당(reducing sugar)의 성질을 이용하여 디나이트로살리실산(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)이 환원되어 생성된 3-amino-5-nitrosalicylic acid의 흡광도를 측정하여 설탕의 당을 정량한다.
3.Principle
◆
◆비색법 (colorimetry)
시료 속의 구하려는 성분 자체나, 시료에 어떤 시약 용액을 넣을 때에 백색광의 일부분을 흡수하여 나타내는 색깔의 짙기를 표준물질의 세기와 비교, 측정하여 성분의 함령을 결정하는 분석법이 비색법이다. 고체나 기체의 발색을 이용할 수도 있으나, 보통 용액의 발색을 이용할 때가 가장 많다. 곧 시료를 용액으로 만들어 분리, 농축 또는 방해하는 물질을 제거하고, 적당한 시약을 넣어 발색반응으로 나타내는 색깔의 짙기를 비교·측정하는 조작을 포함하게 된다. 옛날의 분석은 가시광선에만 한정되었으나, 측정기기가 발달함에 따라 가시광선보다 파장이 긴 쪽이나 짧은 범위까지의 전자복사선을 써서 시료 속의 이온 또는 분자에 의한 선택적인 빛의 흡수의 세기를 측정함으로써 시료의 성분농도를 알게 되었다. 이러한 방법을 통틀어 흡수광도법이라고 하며, 작은 입자가 분산되어 있는 서스펜션의 흐림도를 투과광의 세기로서 측정하는 방법은 비탁법이라고 한다. 백색광을 그대로 쓰지 않고, 광원으로부터 나온 복사선을 필터와 같은 분광기로 어떤 특정한 좁은 파장 범위의 빛으로 분광하여 측정용액에 통과시킬 때 투과하여 나오는 복사선의 세기를 측정하는 방법은 비색법이며, 필터 대신에 프리즘이나 회절발과 같은 단색화 장치를 써서 매우 좁은 파장범위의 단색광을 측정용액에 통과시킬 때는 특히 분광광도법이라 한다. 흡수광도법의 장점은 예민한 발색반응에 의하여 미량의 성분을 간편 신속하게 정량할 수 있는 점이다. 곧 무게분석법이나 부피분석법에서는 0.1% 이하의 성분이 포함되어 있을 때에는 분석의 오차가 매우 커지나, 흡수광도 분석법은 % 범위의 미량성분의 정량에 적당하며, 조건만 잘 조절 선정하면 상대오차 1% 정도 이하에서도 분석할 수 있다.
◆ 환원당의 적정에 의한 정량법
이 방법은 자유 카보닐 그룹이 존재하는 환원당이라 불리우는 물질을 이용한다. 이것은 예를들면 과당에 포도당과 케톤기가 들어있는 것처럼 알데하이드 작용기의 산화를 포함합니다. 동시에, 3.5-dinitrosalicylic acid은 산성 조건 하에서 3-amino-5-nitrosalicylic acid으로 환원된다. ► aldehyed group →(산화) carboxyl group ► 3.5-dinitrosalicylic acid →(환원) 3-amino-5-nitrosalicylic acid 용해된 산소는 그 자체가 색깔 반응을 하는데 충분하지 않은 포도당 산화에 의해서 방해받을 수 있기 때문에 아황산염은 용해된 산소를 흡수하는 시약에 추가된다. 위의 반응은 1몰의 설탕은 1몰의 3.5-dinitrosalicylic acid와 반응할 것임을 보여준다.
4.Material
maltose(환원당,1mg/ml)
Sample – Fructose(미지농도 - 제조 후 10배, 100배 희석)
– 설탕(미지농도) : 측정
3,5-DNS : 0.1g, Na-K Tartrate(Rochelle salt) : 30g, NaOH 0.1g, d.w: 100ml
저울, 메스실린더, 부피플라스크, 얼음, test tube, 교반기,
분광광도계(Spectrophotometer), 피펫
5.Method
(1) Test tube 10개를 준비 후, maltose를 농도 별로 7개 tube에 넣고(표준용액),
Sample 3개를 각각 3개의 tube에 넣는다. 그 후 DNS 2ml를 tube에 넣는다.
(2) 반응 10분(under heat)
(3) 온도를 낮추어 반응을 정지시키기 위해 15분간 Icing.
(4) UV abs 측정(550nm)
(5) Calibration Curve를 구한 후 sample의 정량범위를 확인한다.
7. DISCUSSION & CONCLUSION
[데이터 분석]
DNS method는 Lowry method과 마찬가지로 흡광도 측정을 통하여 물질을 정량하는 실험이다. 단지 측정하는 물질이 단백질에서 당으로 바뀐 정도의 차이가 있다. 우리가 이번실험에서 측정하여 정량하고자 했던 당은 환원당으로써 환원말단을 가진다. 실험에 대조군으로는 설탕을 사용하였는데 이것은 환원 말단을 가지지 않는 물질이다.
실험과정은 maltose를 이용하여 표준곡선을 그린 후, 각각의 sample의 흡광도를 비교하여
Sample의 미지농도를 측정하는 것이다.
각각의 Sample의 농도는 다음과 같다. 1823.53 ㎍/ml(10배 희석), 176.47 ㎍/ml(100배 희석) 측정 결과 희석도는 약 1:10의 비율을 띠므로 sample의 희석은 비교적 잘 이루어졌다. 단, Standard Curve의 곡선이 고르지 못하지만, R2의 값이 0.872934을 나타낸 것으로 보아신뢰성 있는 그래프라고 생각된다.
디스커션은 되도록비공개로 ^^
8.Reference
생화학, LARRY G.SCHEVE, 유한문화사, p.157대학 분석 화학, 이흥락, 학문사, p.431~432염료화학, 김공주, 대광서림, p.42~43생화학 요론, 김창한, 유한문화사, p.26
http://blog.naver.com/istyle333?Redirect=Log&logNo=60095902755
http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=ahreum319&logNo=50024773268
http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=kjh880129&logNo=20067006702
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